微生物生化實驗室　Microbial Biochemistry Laboratory

〈理學院大樓 300-1 室〉

　　以微生物篩選為主，從中獲取活性物質，進行純化、性質之測定及應用為研究之主要目標。本人於大學時代起就參與應用微生物研究，民國七十六年修研博士班開始參與從微生物中進行大規模之酵素生產菌之篩選，成功地自土壤中分離多株會對醣類反應之氧化酵素生產菌株。Acremonium strictum  T1生產之葡糖寡糖氧化酵素 ，也順利突變出比T1野生株產量高75倍的變異株T-38；因為研究較早此酵素一直是研究雙醣類氧化酵素中被引述範例。

（一）甘油氧化酵素之研究及開發之研究：

　　此計劃由國科會兩年之經費補助，成果刊載在 Enzyme Microbial Technol.。此甘油氧化酵素由青黴菌生產，是本人離開學校之第一個篩選酵素。酵素之基質反應性也不同於文獻已報告之性質。正積極尋求開發此甘油氧化酵素在測量血清三醯甘油酯之可能研究性。

（二）鹼性脂肪酵素之研究：

　　此計劃由國科會一年之經費補助，是第二個篩選出之酵素，主要以開發鹼性脂肪酵素在清潔劑之應用，篩選出一株經鑑定為 Pseudomonas pseudoalcaligenes F-111 之菌株，可分泌高產量之鹼性脂肪酵素。此鹼性脂肪酵素已被純化，性質也測定。基因及其調控機制之基因也被選殖且定序，業已獲得中華民國及美國專利。酵素之生產及純化之性質已刊載在 Biotechnol. Letters、Appl. Environ. Microbiol. 及 J. Ferment. Bioeng. 等期刊。未來希望藉此脂肪酵素應用於食品、製藥等合成上。有關基因之研究也將陸續發表。

（三）葡萄五糖分解酵素之研究：

　　本研究室最近進行澱粉水解酵素篩選中，發現一株革蘭氏陰性細菌在含葡萄糖及澱粉為碳源的培養基中，可生成麥芽四糖、麥芽五糖及麥芽六糖等寡糖。粗酵素液經由純化，初步以 SDS-PAGE 分析得一分子量 67,000 的單一色層蛋白質。本酵素可對麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖作用具專一性，因此依其受質水解特性將此酵素命名麥芽五糖澱粉水解酵素。麥芽寡糖可用於醫療及食品用途上。也已完成將澱粉水解生成麥芽四糖、麥芽五糖及麥芽六糖等寡糖之工業製程。

（四）纖維二糖之氧化酵素開發之研究：　

　　由土壤中篩選能生產寡醣氧化酵素之菌種。編號為 E-189，此一菌株在麩皮培養基中培養時能夠分泌可氧化纖維二糖之氧化酵素。純化酵素基於其酵素基質專一性命名為纖維二醣氧化酵素。此酵素可能參與纖維素分解系統有關，正積極了解其在生質能源再生系統研究。成果將投載於 Enzyme Microbial Technol.。

（五）微生物生產紅色色素之研究：　

　　在一連串篩選中，意外篩選出一株細菌會生產胞內紅色色素，及一株黴菌會生產胞外紅色色素，細菌生產之胞內紅色色素經純化之結構分析可能是不同於目前發表之類胡蘿蔔素之新型類胡蘿蔔素紅色色素構造。而黴菌會生產胞外紅色色素，則不同於一般紅黴菌（Anaka）生產紅色色素。初步之應用可能與抗菌有關，現正積極研究中。

（六）細菌生產抑真菌物質之研究：　

　　最近又在篩選黴菌之過程中，發現一可抑制病黴菌（Candida）生長之細菌。此一抗菌物質初步純化為一水溶性、耐熱等特性，於極低之作用濃度下就能抑制黴菌之效果。確立其為一極性極高，且分子量約為一千左右之低分子。證之文獻，有關抗真菌物質之結構中，屬於高極性且低分子量，是非常稀少，也是目前實驗之主力，正朝生物農藥之方向開發。

（七）細菌生產抗生物質之研究：　

　　在篩選黴菌之過程中，發現一可抑制細菌（bacteria）生長之細菌菌株。此一抗生物質初步已完成最適生產條件、穩定等特性，於極低之作用濃度下就能抑制黴菌之效果。確立其為一極性極高，且分子量約為一千左右之低分子。證之文獻，應為一新型抗生物質。

（八）葡萄寡糖氧化酵素轉化生成硫化寡糖之研究：

　　隨著生技市場蓬勃之發展，機能性保健食品之盛行，無疑地加深特用化學品之開發；最近利用硫化寡糖酸衍生物製成抗血栓或阻止癌細胞擴散增生之生技製品，有極大開發價值。如 Martin 等人所合成的 Maltodapoh 化合物（N,N-1,3-propan-2-ol- bismaltobionic acid amide 硫化物），是以麥芽糖進行化學氧化生成麥芽糖酸（maltobionic acid），二分子麥芽糖酸再與一分子 1,3 diamino- 2-propanol 反應，生成 bismaltobionic acid amide 後，再將其行硫化反應而成 Maltodapoh 化合物，具有抗血栓及阻止癌細胞擴散增生之效果。本實驗室現已開發有葡萄五糖生成酵素及葡萄寡糖氧化酵素，因此只要將澱粉與葡萄五糖生成酵素作用，就可獲得葡萄五糖；葡萄五糖再與葡萄寡糖氧化酵素作用，可得到各種葡萄寡糖酸。再以上述之步驟轉化生成硫化寡糖酸衍生物。而此硫化寡糖酸衍生物的效果會比麥芽糖酸更好。

畢業之後繼續篩選，前期代表是Pseudomonas pseudoalcaligenes F-111生產之鹼性脂肪酵素及Penicillium屬之甘油氧化酵素。F-111之鹼性脂肪酵素的研究算是很完整地，由生產純化性質及基因選殖都涵蓋。其中於培養基中添加tritonX-100大量提升酵素之生產也常被論文引述。基因選殖時也發現F-111基因是由兩個基因所形成的operon (分別為lip A及 lip B)，要表現脂肪酵素(lip A)時需要另一基因( lip B)的協助。推論 lip B是扮演chaperon的角色。對革蘭氏菌分泌出蛋白質也算是很特別的。脂肪酵素及甘油氧化酵素可用來開發血清中三醯甘油酯的檢驗。

       另也完成在篩選氧化酵素中常見會出現假象結果的漆酵素，當初以為是一果糖氧化酵素，因無法定量出酵素反應的產物，最後更正為漆酵素。因果糖本身對漆酵素的活性沒有意義的影響，但是硼酸鹽對漆酵素的活性可達60-90％的抑制，相反地，果糖-硼酸鹽複合物在pH 7.5時可增加近4倍的活性之多。此複合物可使漆酵素的最適pH由5.0轉移至7.5，且能充當唯一有效率的媒介分子(Mediator)。硼酸鹽-果糖複合物為第一個發現可作為漆酵素媒介的配糖體。硼酸鹽能與果糖形成複合物可提供一不同的、省時間及特殊的定量果糖的酵素分析方法。本篇論文也被 BioMedLib搜尋資料庫列為2105年在 laccase項目中前20篇論文中第一名。後續也有國內學者利用此成果開發在戴奧辛的分解上，成效可由原先的72天變為3天，並已獲得中華民國專利。

      近三年也開發出兩株對乳糖會氧化的乳糖氧化酵素，分別為Myrmecridium flexuosum NUK-21菌及Paraphaeosphaeria屬NUK-47菌，而NUK-21菌乳糖氧化酵素不僅擁有從未見諸文獻中最好的催化速率及專一性，更超過丹麥的NOVOZYME 的酵素。已將此NUK-21菌乳糖氧化酵素之基因選殖出。 一般糖類氧化酵素常含有FAD，但 NUK-21菌酵素並未測出FAD。由已建構之基因序列分析中，也並未發現有共通FAD結合區域序列(GxGxxG)，證明本酵素不含FAD輔因子。而本氧化酵素卻含有Zn²⁺是很少見，其扮演的角色將再建一步研究。 另，Paraphaeosphaeria屬NUK-47菌之乳糖氧化酵素也完成生產及純化之工作，NUK-47氧化酵素對乳糖、纖維二糖、麥芽糖會反應外，對幾丁寡糖也會，也是一全新的酵素，已通過領證中。

        除了酵素，抗生素的研發也有亮點。在開發肉品中亞硝的取代物，發現一Nigrospora sp. 407菌會分泌出胞外的紅色物質對革蘭氏陽性菌如結核桿菌及肉毒桿菌抑菌效果也非常好。在其結構尚未解析前，我們利用市售含胺基的擔體與紅色抗菌物質進行反應，發現其能穩定固定於擔體上，因此初步推論它的組成結構可能含有醛基或酮基。後來此紅色抗菌物質的結構解析出，是屬於喹諾類化合物的一種，帶有二個羰基(C=O)，很類似戊二醛可做為一新穎之交聯劑，能與胺基行自發性的共價結構。因此，利用化學共價結合法及表面改質的技術，經戊二醛及PEI處理於不織布上創造NH2官能基，而能有效將紅色抗菌物質固定於不織布上，成果是我們首創的也在已發表在國外期刊。 Bostrycin具有紅色，也能與蛋白質(肉品)固定又對肉毒桿菌(Clostridium botulium)之抑制效果非常明顯。亞硝做為食品添加物已證明會致癌，但做為能抑制肉毒桿菌的功能則是無可取代的。因此全世界食品化學家無不全力來開發亞硝在抑制肉毒桿菌的替代品，以減少亞硝之致癌性。若能開發一能抑制肉毒桿菌（抗生物質）又具有著色（紅色）之物質，應可解決此問題之可能性。抗生物質應用於食品添加物是不太被允許的，但為減少亞硝之使用率，FDA也被迫允許在食品添加乳酸菌生產之抗生物質（nisin），也證明亞硝問題之急迫性。因此本實驗室開發的紅色抗菌物質未來及在醫藥及食品用途上極具開發潛力。

高效能液體層析儀 五公升發酵槽 循環恆溫箱 減壓濃縮機 分液收集器 分光光度計 迴轉式振盪恆溫培養箱 無菌操作台 pH 計 電子天平 高速離心機 低溫恆溫櫃 -20℃ 冰箱
五公升發酵槽　〈5L-Ｆermentor〉	減壓濃縮機　〈RPC〉
高效能液體層析儀　〈HPLC〉	高速離心機　〈Ｈigh-Ｓpeed Ｃentrifuge〉

林順富　Lin Shuen-Fuh　教授

辦公室：理學院大樓 300 室　實驗室：理學院大樓 300-1 室

聯絡電話：886-7-5919227，校內分機：7227

E-mail： sflin@nuk.edu.tw